ANEXO TÉCNICA CH50

Fundamento

Para el análisis de la vía clásica del complemento se puede utilizar la cuantificación de la actividad hemolítica del complemento sérico, mediante la técnica CH50.

Técnica

1. Preparar los eritrocitos de carnero (E):

- Lavar 5 ml de eritrocitos de carnero con PBS y resuspenderlos en 15 ml de tampón barbital para CH50 en un tubo de 25 ml.

- Homogeneizar la suspensión de E y transferir 0,5 ml a un tubo con 12,5 ml de agua destilada para lisar los eritrocitos.

- Leer la absorbancia de la solución a 540 nm frente a un blanco de agua destilada.

La absorbancia debe ser 0,50. 

Suponemos que se obtiene una absorbancia de la primera lisis de 0,75. Sabiendo que la absorbancia de una suspensión al 6% es de 0,50, se calcula cuál es la concentración que corresponde a la absorbancia obtenida.

6% / 0,5 =  x / 0,75 → x = 9%

Teniendo en cuenta la relación entre diluciones se calcula el volumen final que debe tener la suspensión de eritrocitos para ajustar la concentración al 6%

14,5ml / 9% = 𝚅´6%

𝚅´= 21,75 x ⥴ 22 ml

Será necesario diluir con tampón barbital los 14.5 del tubo original de 25 ml para llevarlos hasta 22 ml

2. Sensibilizar los eritrocitos con anticuerpos (EA).

3. Preparación de las diluciones de suero problema.

4. Cálculo de los resultados.

TÉCNICA DE FICOLL: SEPARACIÓN CELULAR POR GRADIENTE DE DENSIDAD

PRÁCTICA 12:

TÉCNICA DE FICOLL: SEPARACIÓN CELULAR POR GRADIENTE DE DENSIDAD

Objetivos

Observación al microscopio de células sanguíneas obtenidas de esta técnica

Observación de las diferentes capas obtenidas y su contenido

Fundamento

La técnica de Ficoll es una técnica de centrifugación por gradiente de densidad para separar Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) de otras células de la sangre. Durante la centrifugación se van formando varias capas debido a las diferentes densidades. El sedimento está formado principalmente por granulocitos y eritrocitos que han migrado a través del medio por tener mayor densidad que el Ficoll y por la tendencia a formar agrupaciones (en el caso de granulocitos). Encima se situaría la capa de Ficoll, que es menos denso que el sedimento. Encima del Ficoll habría otra capa fina opalescente constituida por las células mononucleares (linfocitos y monocitos) que tienen menor densidad. Finalmente sobre esa capa se situarían las plaquetas y el plasma.

Una vez realizada la centrifugación se recoge la capa mucosa (que contiene los mononucleares) situada entre en el plasma y el Ficoll, con ayuda de una Pipeta Pasteur. En el laboratorio esto se utiliza para realizar diferentes estudios. Nosotros hicimos una extensión, la dejamos secar y tras una tinción con panóptico rápido (fijador, eosina, azul de metileno, agua destilada), observamos al microscopio.

Principalmente se observan linfocitos y plaquetas.

Materiales

• Tubos de plástico de 10 mL estéril

• Ficoll

• Suero Fisiológico estéril (50 mL)

• Pipetas Pasteur de cristal

• Gradilla

• Muestra de sangre con EDTA

• Centrífuga

• Tinción panóptico 

• Microscopio

• Portaobjetos

• EPI: guantes, bata…

Técnica

1. Extraer muestra sangre sanguínea de un compañero

2. Realiza una dilución de sangre y suero salino fisiológico en una proporción 1:1, es decir, dispensar 2 ml de sangre y 2 ml de SSF

3. Dispensar en un tubo de plástico 3 ml de Ficoll y 4 ml de la dilución anterior con cuidado para que no se mezclen.

                                      

4. Centrifugar 1800 rpm durante 25 minutos

                                            

5. Recoger la fracción de leucocitos con una pipeta pasteur con mucho cuidado para no llevarnos la capa superior y depositarlo en un eppendorf.

          

5. Realizar una extensión y dejar secar

                

6. Teñir la extensión con panóptico rápido:

- 5 inmersiones de un segundo en la solución fijadora.

- 5 inmersiones de un segundo en eosina

- 5 inmersiones de un segundo en azul de metileno

- 5 inmersiones de un segundo en agua destilada.

7. Dejar secar y observar al microscopio

Restultado:

Principalmente se observan linfocitos y plaquetas, aunque también se aprecia algún cuerpo sin segmentar. En la parte de la izquierda se observa una célula que podría parecer que tiene un núcleo segmentado, podría tratarse de un neutrófilo.

Los linfocitos se observan como células redondas y pequeñas con un gran núcleo que se tiñe de violeta-azul y ocupa casi toda la célula. En este caso no podemos observar el citoplasma, porque el núcleo ocupa su totalidad.

Las plaquetas se observan como pequeños puntos, de menor tamaño que los linfocitos, de coloración violeta, pero más claro que los linfocitos. Aparecen por el campo de forma dispersa o formando agregados.

          

         

VRDL

PRÁCTICA 11- 

VRDL Y THPA

Objetivo

Determinación sérica de anticuerpos dirigidos contra la bacteria Treponema pallidum, causante de la sífilis o contra treponemas patógenos.

Fundamento

La VRDL y THPA son pruebas serológicas que se utilizan para detectar la sífilis, una enfermedad infecciosa de transmisión sexual, contagiosa muy expandida, producida por la bacteria Treponema pallidum Un rápido diagnóstico permitirá tratar la enfermedad en una etapa inicial antes de que los síntomas se agraven.

Las pruebas de detección para sífilis son una parte rutinaria del cuidado prenatal durante el embarazo, ya que la embarazada tiene sífilis, puede transmitirle la infección a su bebé en gestación.

La VRDL (Venereal Disease Research Laboratory)  es una prueba no treponémica que detecta los  anticuerpos que no van dirigidos específicamente contra la bacteria Treponema pallidum, sino contra todos los treponemas patógenos. Por lo tanto, el organismo produce estos anticuerpos ante una sífilis pero también en otras situaciones. Nosotros hemos realizado la VRDL.

La HTPA (Treponema Pallidum Haemaglutination Assay) es una prueba prueba treponémica que detecta específicamente anticuerpos dirigidos contra Treponema pallidum, identifica el antígeno cardiolipídico.

La determinación plasmática de dicho anticuerpos se realiza ensayando la muestra problema con un reactivo que contiene los antígenos. La presencia o ausencia de una floculación visible al microscopio es indicativa de la presencia o ausencia de dichos anticuerpos en la muestra problema.

Los resultados de las pruebas TPHA y VDRL pueden variar según las técnicas utilizadas por los laboratorios, por tanto, los resultados no constituyen un diagnóstico. Es necesario consultar a un médico con el fin de prever exámenes complementarios o un eventual tratamiento.

Materiales

-          Kits comerciales para la determinación de VDRL y TPHA. (que incluyen control positivo, control negativo y reactivo)

-           Muestra de suero problema.

-          Placas multipocillos o tarjetas de diluciones.

-          Micropipetas variables y puntas de micropipeta.

-          Palillo.

-          Rotatorio

-          Microscopio

Técnica : VRDL

1. Equilibrar los reactivos y muestras a temperatura ambiente.

2 Depositar una gota del control positivo en el primer pocillo (aproximadamente 50 microlitros)

2. Depositar una gota del control negativo en el segundo pocillo (aproximadamente 50 microlitros).

3. Depositar una gota del suero problema en el tercer pocillo (aproximadamente 50 microlitros).

4. Depositar una gota de reactivo en cada pocillo (aproximadamente 50 microlitros).

5. Mezclar las gotas con un palillo extendiendo la disolución por todo el pocillo. Utilizar un palillo para cada pocillo.

6. Agitar manualmente.

7. Observación.

Resultado

La lectura se puede hacer macroscópica y microscópicamente.

                             

Un resultado positivo se observaría con la presencia de aglutinación, lo que significaría la presencia en el suero de anticuerpos contra la bacteria. Por el contrario, un resultado negativo, sin aglutinar, significaría que la muestra no contiene los anticuerpos contra la bacteria.

Resultado positivo a la izquierda y negativo a la derecha.

En la lectura microscópica, La presencia de una floculación es indicativa de la presencia de dichos anticuerpos en la muestra problema. Y la ausencia de la floculación indicaría la ausencia de los anticuerpos.

 Resultado negativo

 Resultado positivo

ROSA DE BENGALA

PRÁCTICA 10- 

ROSA DE BENGALA

Objetivo

Determinación cualitativa de anticuerpos anti- brucella.

Fundamento

BACTERIA DE BRUCELLA
Causante de la Brucelosis

La brucelosis, también llamada fiebre de Malta, fiebre mediterránea, fiebre ondulante, o enfermedad de Bang, es una enfermedad zoonótica infecciosa de distribución mundial, producida por bacterias del género Brucella. 

El diagnóstico de la brucelosis puede establecerse bien sea por el aislamiento del microorganismo en sangre en heces, o por la demostración de la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente.

La prueba Rosa de Bengala es una técnica rápida de aglutinación para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos anti-Brucella en sueros de animales y humanos.

La determinación se efectúa ensayando la suspensión tamponada (pH 3,6) de Brucella coloreada con Rosa de Bengala frente a los sueros problema. El reactivo, es capaz de reaccionar con anticuerpos IgG o IgM, por lo que es muy útil para el diagnóstico de individuos en fase crónica de la enfermedad, los cuales presentan un nivel elevado de anticuerpos IgG difícilmente detectables por el método tradicional de aglutinación en tubo.

La presencia de Brucella se observa con aglutinación (control positivo) y la ausencia de la muestra se identifica cuando no existe aglutinación (control negativo). La muestra problema no muestra aglutinación, por lo que es negativa, y por tanto no contiene los anticuerpos específicos para Brucella.

 Materiales

- Tarjetas de diluciones

- Reactivos para rosa de bengala (contro positivo, control negativo y reactivos)

- Palillo para mezclar

- Micropipeta de 50 μL

- EPI: guantes, bata…

Técnica

1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas.

2. Depositar 50 μL de control positivo en el primer pocillo, 50 μL de control negativo en el segundo pocillo y 50 μL de el suero problema en el tercer pocillo.

3. Homogeneizar suavemente el reactivo de rosa de bengala antes de usar. Depositar una gota en cada pocillo junto a cada una de las gotas anteriores.

4. Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del círculo. Emplear distintos palillos para cada muestra.

5. Mover la tarjeta lentamente y observar el resultado.

Resultado

Un resultado positivo se observaría como en el control positivo con la presencia de aglutinación, lo que significaría la presencia en el suero de los anticuerpos anti-Brucella. Por el contrario, un resultado negativo se apreciaría como en el control negativo, sin aglutinar, lo que significaría que la muestra no contiene los anticuerpos contra la enfermedad.

Como podemos ver en nuestra práctica la gota de la muestra no aglutina al igual que el control negativo. Por lo tanto, la muestra no tiene y la persona de la muestra no tiene los anticuerpos anti-Brucella y no hay indicios de tener brucelosis.