ANEXO TÉCNICA CH50

Fundamento

Para el análisis de la vía clásica del complemento se puede utilizar la cuantificación de la actividad hemolítica del complemento sérico, mediante la técnica CH50.

Técnica

1. Preparar los eritrocitos de carnero (E):

- Lavar 5 ml de eritrocitos de carnero con PBS y resuspenderlos en 15 ml de tampón barbital para CH50 en un tubo de 25 ml.

- Homogeneizar la suspensión de E y transferir 0,5 ml a un tubo con 12,5 ml de agua destilada para lisar los eritrocitos.

- Leer la absorbancia de la solución a 540 nm frente a un blanco de agua destilada.

La absorbancia debe ser 0,50. 

Suponemos que se obtiene una absorbancia de la primera lisis de 0,75. Sabiendo que la absorbancia de una suspensión al 6% es de 0,50, se calcula cuál es la concentración que corresponde a la absorbancia obtenida.

6% / 0,5 =  x / 0,75 → x = 9%

Teniendo en cuenta la relación entre diluciones se calcula el volumen final que debe tener la suspensión de eritrocitos para ajustar la concentración al 6%

14,5ml / 9% = 𝚅´6%

𝚅´= 21,75 x ⥴ 22 ml

Será necesario diluir con tampón barbital los 14.5 del tubo original de 25 ml para llevarlos hasta 22 ml

2. Sensibilizar los eritrocitos con anticuerpos (EA).

3. Preparación de las diluciones de suero problema.

4. Cálculo de los resultados.

TÉCNICA DE FICOLL: SEPARACIÓN CELULAR POR GRADIENTE DE DENSIDAD

PRÁCTICA 12:

TÉCNICA DE FICOLL: SEPARACIÓN CELULAR POR GRADIENTE DE DENSIDAD

Objetivos

Observación al microscopio de células sanguíneas obtenidas de esta técnica

Observación de las diferentes capas obtenidas y su contenido

Fundamento

La técnica de Ficoll es una técnica de centrifugación por gradiente de densidad para separar Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) de otras células de la sangre. Durante la centrifugación se van formando varias capas debido a las diferentes densidades. El sedimento está formado principalmente por granulocitos y eritrocitos que han migrado a través del medio por tener mayor densidad que el Ficoll y por la tendencia a formar agrupaciones (en el caso de granulocitos). Encima se situaría la capa de Ficoll, que es menos denso que el sedimento. Encima del Ficoll habría otra capa fina opalescente constituida por las células mononucleares (linfocitos y monocitos) que tienen menor densidad. Finalmente sobre esa capa se situarían las plaquetas y el plasma.

Una vez realizada la centrifugación se recoge la capa mucosa (que contiene los mononucleares) situada entre en el plasma y el Ficoll, con ayuda de una Pipeta Pasteur. En el laboratorio esto se utiliza para realizar diferentes estudios. Nosotros hicimos una extensión, la dejamos secar y tras una tinción con panóptico rápido (fijador, eosina, azul de metileno, agua destilada), observamos al microscopio.

Principalmente se observan linfocitos y plaquetas.

Materiales

• Tubos de plástico de 10 mL estéril

• Ficoll

• Suero Fisiológico estéril (50 mL)

• Pipetas Pasteur de cristal

• Gradilla

• Muestra de sangre con EDTA

• Centrífuga

• Tinción panóptico 

• Microscopio

• Portaobjetos

• EPI: guantes, bata…

Técnica

1. Extraer muestra sangre sanguínea de un compañero

2. Realiza una dilución de sangre y suero salino fisiológico en una proporción 1:1, es decir, dispensar 2 ml de sangre y 2 ml de SSF

3. Dispensar en un tubo de plástico 3 ml de Ficoll y 4 ml de la dilución anterior con cuidado para que no se mezclen.

                                      

4. Centrifugar 1800 rpm durante 25 minutos

                                            

5. Recoger la fracción de leucocitos con una pipeta pasteur con mucho cuidado para no llevarnos la capa superior y depositarlo en un eppendorf.

          

5. Realizar una extensión y dejar secar

                

6. Teñir la extensión con panóptico rápido:

- 5 inmersiones de un segundo en la solución fijadora.

- 5 inmersiones de un segundo en eosina

- 5 inmersiones de un segundo en azul de metileno

- 5 inmersiones de un segundo en agua destilada.

7. Dejar secar y observar al microscopio

Restultado:

Principalmente se observan linfocitos y plaquetas, aunque también se aprecia algún cuerpo sin segmentar. En la parte de la izquierda se observa una célula que podría parecer que tiene un núcleo segmentado, podría tratarse de un neutrófilo.

Los linfocitos se observan como células redondas y pequeñas con un gran núcleo que se tiñe de violeta-azul y ocupa casi toda la célula. En este caso no podemos observar el citoplasma, porque el núcleo ocupa su totalidad.

Las plaquetas se observan como pequeños puntos, de menor tamaño que los linfocitos, de coloración violeta, pero más claro que los linfocitos. Aparecen por el campo de forma dispersa o formando agregados.